免疫细胞化学图像分析常用的测量参数

1、灰度

灰度(grey level)指图像各种分颜色的深浅程度。比较高级的图像分析仪可将灰度分成为256级,也有的只能将灰度分成64级,总之都是2n,24是26256是28。免疫细胞化学标本上反应产物的染色深浅即可用灰度来表示。能将一张标本上不同染色深度区分为几十或更多的等级,这是人眼所不及的。因此,某些实验的结果,如果用光学显微镜作一般的观察,似乎实验组与对照组无明显差异,而用图像灰度法经统计学分析,则可反映出显著性差异,说明仅仅用显微镜观察是不够的,在某些情况下可能会辜负了制片过程中所花费的大量精力,而得不到应有的结果。

由于免疫反应产物在细胞内不一定是均匀分布的,在同一个细胞中就可产生各种灰度,这种情况如何进行比较？有两类方法可供选用：一种是测每个细胞的平均灰度,近年较新型的图像分析系统有此性能,而比较早期的或比较简单的图像分析系统就没有这种性能,例如某一细胞在电视屏幕上占有120个像素,按灰度级进行测量后,也许120个像素中有十多种不同的灰度,分析仪可立即显示其平均灰度。另一种方法是在反应产物不均匀的细胞中可用每一种灰度所占的百分率来表示,例如你要观察1000个细胞,在这些细胞中各种灰度所占的百分率可测出,并作出曲线,或用其他统计学方法处理,来进行比较。

如果用彩色图像分析仪,除了上述的灰度测量以外,还可以将不同的灰度编成不同的颜色,使图像更鲜明美丽,而且便于测量。彩色有两种情况：在屏幕上出现与标本一样的颜色称为真色(real color),如果将不同的灰度转换成不同的颜色则称为假色(pseudo color),应用假色的目的是增强对比度,来改善对细胞结构的视觉识别,同时可增强轮廓用来强调结构的细节 。例如,免疫细胞化学中常用的非标记抗体过氧化物酶—抗过氧化物酶法,最终反应产物呈棕色,假设在脑内某核团的许多细胞中,呈现出不同深度的棕色,深浅差别较大者显示在屏幕上人眼还能区别,若差别小的则不易区别了,操作者可将灰度11～15用红色显示,灰度16～20用蓝色显示、灰度21～25用黄色显示、灰度26～30用绿色显示等。一般可呈现数十种颜色。也可以将灰度11～20用深红色显示、灰度21～30用淡红色显示、灰度31～40用蓝色显示等,由操作者随心所欲加以编辑。这种图像如拍摄下来,旁边显示出一条彩色带,表明什么颜色代表什么范围的灰度,如此可将一种颜色的免疫细胞化学标本转换成多种彩色的,对比鲜明的照片。

有些图像分析仪中带有光密度计组件,光密度计能将扫描器视频信号变换成对数等值,然后数值化,就能用绝对光密度单位来校正。因此,光密度计把被测物的积分光密度作为主要输出,所谓积分光密度即各个单独探测的像素密度分布的总和。因为容易得到被测物的面积,也就很容易求出平均密度。光密度在细胞化学反应的定量领域内极为有用。灰度是一种相对值,因为你可将标本上的灰度随你编辑分为64级、也可将其分为128级或者256组,而光密度是绝对值。在文献中光密度常用OD表示(optical density)。有的单位购置了图像分析仪后才发现不能作光密度测量,但已无法再去掉换,所以在购买前必须详细了解其性能,包括屏幕像素数、有无光密度计组件等。2、长度

形状不规则的线形组织结构,一般方法很难计算出其长度,如组织中的毛细血管,神经纤维、细胞超微结构中的各种膜性结构等,以往常用排列稀疏或密度集等词描述,图像分析仪则可测出各种图像周界线的长度。例如：在活检组织的子宫颈上皮细胞的电子显微镜照片上,测出在一定范围的细胞膜长度为8128像素,桥粒长度为1229像素,计算出桥粒长度占细胞膜总长度的15%,wiernik等用此方法观察到癌细胞的桥粒值远小于正常细胞,提出这可能与癌细胞易于失去相互间的的细胞连接,从而形成转移有关。用免疫细胞化学法显示的神经纤维,在局部组织中可能出现纵横交错的复杂图像,用图像分析仪可获得单位面积内神经纤维的总长度。又如去甲肾上腺素神经纤维呈串珠样,如果测出一定范围内神经纤维总长度及局部膨大数目,即可计算出串珠平均间隔距离,比较精确。3、面积

无论是在光镜或电镜免疫细胞化学标本的观察中,都要涉及有关标本中某些结构的面积问题。即使是极不规整的结构,用图像分析法容易算出其面积。在一定的放大倍数下,每μm2中含多少像素可以测出,画出待测结构的轮廓,在所勾画的范围内含多少像素是立即可显示出来的,这样,很快可算出面积的数值。例如免疫电镜技术中的铁蛋白法、胶体金法等,可用上述方法进行单位面积中反应产物颗粒的计数,可进行各种实验条件的比较。

曾有人在肝脏切片上进行图像分析,在一定范围内所有细胞核的总面积显示为51554像素,其中肝细胞核总面积为27431像素,可知肝细胞核占全部细胞核总面积的53%。