斑点杂交

斑点杂交(Dot blot)是将被检标本点到膜上,烘烤固定。这种方法耗时短,可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品,为使点样准确方便,市售有多种多管吸印仪(Manifold),如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它们有许多孔,样品加到孔中,在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔,取出膜烤干或紫外线照射以固定标本,这时的膜就可以进行杂交。 (1)DNA斑点杂交： ①先将膜在水中浸湿,再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。 ④将膜烘干,密封保存备用。 (2)RNA斑点杂交：与上法类似,每个样品至多加10μg总RNA(经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化),方法是将RNA溶于5μl DEPC水,加5μl甲醛/SSC缓冲液(10×SSC中含6.15mol/L甲醛),使RNA变性,然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上,烘干。 (3)完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法,可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测,将整个细胞点到膜上,经NaOH处理,使DNA暴露、变性和固定,再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本,因为它使细胞直接在膜上溶解,所以DNA含量甚至比常用的提取法还高,又不影响与32P标记的探针杂交,但它不适用于非放射性标记探针,因为DNA纯度不够,会产生高本底。